20分的LncRNA文章是如何炼成的
LncRNA的火热研究已经有几年的时间了，并且从目前的趋势来看lncRNA研究热度不减。对于lncRNA的研究，现在基础的分析都形成了一定的模式：cis-regulation/trans-regulation、lncRNA-mRNA coexpression、ceRNA等，最后再加上个qPCR验证，在保障结果有效的情况下发个2-5分的文章还是没啥问题的。
在我个人看来，对目前做各类分子研究的研究者来说，已有的基础理论其实就是我们所谓的“套路”，沿着这条主干道往下走，就好像去一个山脉寻宝一样，不同的人会选择去不同的山头，寻到的宝自然也不一样，有人毅力大能爬到很高的地方，那里自然宝物更多，因为去的人少。做研究也是一样，如果毅力够大且装备精良，自然能够有更大的机会寻到更为贵重的宝物。前提是—你得沿着主干道去走，当然也有一些人不沿着主干道去走，这样的选择更为艰难和未知，也许会获得一片新的天地，也许会一无所获。
说了这么多，回归主题，今天想带大家看一下同样是lncRNA研究，那些20分的文章是怎么做出来的。下面我们通过一篇lncRNA文章来看一下别人的高分文章都做了些啥？
文章标题：LncRNA GClnc1 Promotes Gastric Carcinogenesis and May Act as a Modular Scaffold of WDR5 and KAT2A Complexes to Specify the Histone Modifi cation Pattern
杂志名称：Cancer Discovery(IF=19.783)
研究方向：医口（胃癌）
基础研究手段：芯片（Arraystar Human LncRNA Microarray V2.0 (8×60KArraystar) 芯片或者测序都无所谓，它们的功能有很大重复性，联川生物可提供相关产品服务）
研究材料：10个胃癌病人的癌症组织和癌旁组织
初步筛选结果：筛选到了8个在癌症和癌旁组织中显著差异表达的lncRNA（芯片信号值大于1500，一般我们要求芯片信号值大于500即可；两倍差异以上以及P值小于0.01）
大量qPCR验证：选取165例癌症和癌旁组织对这8条lncRNA进行验证，发现其中4条lncRNA在胃癌组织中表达量相对癌旁组织显著上升
Kaplan–Meier分析：发现只有一条lncRNA的异常表达与胃癌是显著相关的，并且表达量从正常胃组织到胃癌的四个阶段是逐渐增加的。作者因此预测此条lncRNA跟胃癌的发生密切相关，并将其命名为GClnc1。
接下来作者为了验证GClnc1在胃癌中病理学和临床的显著性，做了原位杂交实验，用的是另外105对石蜡包埋的胃癌组织和癌旁组织，发现GClnc1在胃癌组织中的表达量明显比癌旁组织中要高。
接下来为了验证GClnc1是否是一个新的lncRNA序列，作者又使用了Northern blot和5’ RACE以及ChIP对GClnc1进行了验证，并进行了ORF预测，还将细胞质核分离进行qPCR进行验证，最终确定GClnc1是一条新的并且在胃癌组织中高表达的lncRNA。
为了进一步验证GClnc1跟胃癌的关系，作者将GClnc1敲除，再利用RNA-Seq对敲除后的样本进行测序，发现敲除后发生表达差异基因大部分跟胃癌相关，并且，后续的相关功能性实验也证明了GClnc1可以促进癌细胞的增殖和入侵，最终导致胃癌的发生。
LncRNA研究的套路之一是其可以与转录因子进行结合互作，为了验证GClnc1是否也具有这样的功能，作者利用RNA PULL DOWN实验，利用质谱的方法对PULL下来的蛋白进行鉴定，共鉴定到接近200个蛋白，并且对其中10个跟转录调控的蛋白进行Western blot验证，发现只有WDR5和KAT2A可以和GClnc1特异性结合。且WDR5是H3K4甲基转移酶，而KAT2A是H3K9乙酰转移酶。最后， siRNA和RIP实验证明了GClnc1可与WDR5以及KAT2A结合形成复合物。
再接下来，作者利用ChIP-Seq方法去验证GClnc1是否可以调控蛋白WDR5和KAT2A在全基因组的结合位点。得到的结果是GClnc1敲低后会使WDR5和KAT2A在全基因组上的结合能力下降，并抑制相关基因的表达。因此敲低GClnc1会损害WDR5和KAT2A形成复合物，表明了GClnc1可以作为这种复合物的支架分子，从而调控组蛋白修饰、基因表达和生物学活性。
根据ChIP-Seq和RNA-Seq结果，作者发现SOD2是WDR5和KAT2A复合物的一个靶基因，并且发现GClnc1和SOD2具有高度正相关关系，并且利用CRISPR/Cas9去敲除SOD2，最终得到结论：SOD2确实在胃癌中受到GClnc1的调控。
最终，作者想研究GClnc1是如何调控SOD2的，他猜测H3K4的甲基化和H3K9乙酰化可能调控SOD2的转录水平，RT-PCR和Westernblot实验也表明敲低WDR5或KAT2A可以减弱由GClnc1诱导的SOD2表达水平的上调。这些数据显示WDR5, KAT2A和GClnc1之间可以通过组蛋白修饰调控SOD2的转录活性，且ChIP实验也说明了WDR5和KAT2A可以直接结合在SOD2的启动子区域，敲低WDR5、KAT2A或GClnc1都会显著降低另外一种蛋白在SOD2上的结合能力，说明GClnc1可调控WDR5/KAT2A和SOD2启动子区域的结合能力。接下来的实验证明SOD2启动子区域存在H3K4me3和H3K9Ac，且GClnc1的表达水平的改变会让H3K4me3和H3K9Ac的丰度也发生变化。ChIRP分析显示GClnc1直接结合在SOD2的启动子区域。
结论
GClnc1可以做为一个支架把组蛋白修饰酶WDR5和KAT2A招募至SOD2的启动子处，从而激活该基因的转录，进而促进胃癌的发生和发展。
终于写到结尾了，大汗淋漓，一篇IF接近20的文章，做的工作之多可想而知，除了大样本的qPCR以外,还做了大量的功能性实验验证，这不仅需要实验设计者的高水平把控，还需要“装备精良”才可以，我们需要感激这些高水平的实验设计者，他们不仅花费了大量的人力物力去探究生命科学中的真谛，更重要的是为其他科研/临床工作者以及后来者指明了方向，也许我们做不到像此篇文章作者那样尽善尽美，但只要严谨踏实，用心做研究，终究你会爬到别人没有到过的山头，寻到属于自己独一无二的宝贝。
改一句古语：无赤心，不研究，研必有方，方为联川。
联川生物真心希望每一位科研/临床工作者付出必有回报，将生命科学之美散播人间。
Piccolo（运营部）丨文案
许洪荧丨编辑
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